方法

動物

42只10周齡的雌性Sprague-Dawley大鼠來自上海SLAC實驗動物有限公司。食物和水自由供應。所有動物實驗方案均經上海體育大學和第二軍醫大學實驗動物倫理委員會批準。

胎盤早剝和E2治療

實驗分兩步進行。首先，21只大鼠被隨機分配到三組：Sham組、OVX組和OVX-E2組(每組n=7)。在戊巴比妥鈉(60毫克/千克)麻醉下進行雙側卵巢切除術。假手術也在戊巴比妥鈉麻醉下進行。給切除卵巢的大鼠皮下注射E2 30μg/kg/d(OVX-E2組)或等體積的芝麻油作為藥物對照(OVX組)。假大鼠在發情期被殺死。測量大鼠體重和子宮重量。收集血清以測定E2水平。收集左心室壁進行活檢，并將其保存在-80℃溫度下，以便隨后測定RNA和蛋白質。為了進行免疫組化分析，將心肌組織置于10%磷酸鹽緩沖福爾馬林中。其次，將另外21只大鼠隨機分配到上述三組(每組n=7)。收集心肌組織以測定H2S生成率、氧化狀態和促炎細胞因子水平。

激素測定

E2使用市售的放射免疫測定試劑盒進行測定。測定內和測定間的平均變異系數分別為5.78%和6.96%。

免疫組織化學

心肌CSE免疫組化分析方法如前所述。簡而言之，制備石蠟包埋切片(5μm)，重新水化，并在檸檬酸緩沖液中微波處理以提取抗原。用3%H2O2淬滅內源性過氧化物酶。切片與大鼠CSE抗體(1：100)在4℃孵育過夜。CSE抗體針對的是與人源CSEC端胞質結構域相匹配的多肽。以3,5-二氨基聯苯胺為顯色劑，用生物素-鏈霉親和素-過氧化物酶系統(UltraSensitive-SP試劑盒)檢測結合情況。陰性對照時，用10倍過量的阻斷肽sc-131905P預吸附一抗。

細胞因子水平的測量

將心肌(100毫克)在1毫升磷酸鹽緩沖生理鹽水中均質化，該生理鹽水中含有2毫摩爾苯甲基磺酰氟和1μg/ml的安替比林、利普汀和抑肽酶A。勻漿在1,000g轉速下離心10分鐘。上清液經0.45μm無菌濾器過濾后，在-80℃下保存，直至用于使用酶聯免疫吸附測定試劑盒測定TNF-α和IL-6。TNF-α和IL-6的平均測定內變異系數分別為2.1%和4.5%。TNF-α和IL-6的平均測定間變異系數分別為8.8%和7.0%。

總RNA提取和定量實時反轉錄聚合酶鏈反應

總RNA提取和定量實時逆轉錄(RT)聚合酶鏈反應(PCR)的方法如前所述。簡言之，使用TRIzol試劑制備總RNA。使用M-MLVRT，用寡聚(dT)引物反轉錄兩微克RNA。在進行PCR分析之前，將得到的互補DNA儲存在-20℃溫度下。CSE(NM_017074)的引物為5'-CGGAGCAATGGAGTTCGC-3'(正向)和5'-GATGGGTAATCGTTGTGGTG-3'(反向)。使用MyiQ Single-Color實時監測PCR系統重復進行實時定量PCR分析。反應溶液由40ng的互補DNA產物、0.1μM配對引物和1×PCR Master Mix組成。檢測染料為SYBR green。根據初步實驗對條件進行了優化，以確保RNA濃度與PCR產物之間的線性關系。退火溫度為58℃。擴增以40個循環進行。檢測PCR產物熔化溫度的溫度范圍設定為60℃至95℃。通過熔解曲線分析和實時RT-PCR產物測序驗證引物特異性。β-Actin用作內對照，用于樣品的加載和歸一化。用算術公式(2-ΔΔCt)比較Ct(閾值周期)法確定CSE信使RNA(mRNA)的相對量。

Western blot分析

蛋白質提取和Western blot分析方法如前所述。簡而言之，組織樣本在冷的T-Per裂解緩沖液中均質化。裂解液在冰浴中快速超聲，在95℃下煮沸5分鐘，并在-80℃下保存直至使用。樣品(50μg蛋白質)經10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺電泳分離后轉移到硝酸纖維素膜上。在室溫下，用含0.1%吐溫-20和5%干奶(重量/體積)的三羥甲基氨基丙烷緩沖鹽水將膜阻斷2小時。用CSE抗體(1：1,000)或3-磷酸甘油醛脫氫酶抗體在4℃下孵育膜過夜。用含0.1%吐溫-20的三相緩沖鹽水沖洗后，用辣根過氧化物酶結合的二級IgG(1：1,000)在室溫下孵育膜1小時。使用增強化學發光西部印跡檢測系統對免疫反應蛋白進行檢測。用密度計和GeneSnap及GeneTools軟件分析條帶的強度。結果以與3磷酸甘油醛磷酸脫氫酶對照的比率表示。

實時測量H2S量

組織中H2S的實時生成量測量方法如前所述。簡而言之，將大約100毫克的大鼠心臟組織在含有蛋白酶抑制劑(2毫摩爾苯甲基磺酰氟、1毫摩爾正釩酸鈉和10毫克/毫升杏仁蛋白)的冷磷酸鹽緩沖鹽水(5毫升)中剁成小顆粒，洗滌三次，勻漿15秒。在5,000rpm轉速下離心5分鐘后，將上清液放入溫控微呼吸室(Unisense)，使用微型H2S微呼吸電極(型號H2S MRCh；Unisense)和Unisense PA2000放大器測量實時H2S產量。使用改良的布拉德福德測定法測定蛋白質濃度。

還原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽含量、總抗氧化能力以及SOD和過氧化氫酶活性的測定

用冷生理鹽水勻漿心肌(100毫克)。勻漿在1,000g轉速下離心10分鐘。還原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)比值、總抗氧化能力(T-AOC)、SOD和過氧化氫酶(CAT)活性的測定采用Winching公司的試劑盒。GSH/GSSG、T-AOC、SOD和CAT的平均測定內變異系數分別為2.8%、3.2%、1.7%和1.9%。GSH/GSSG、T-AOC、SOD和CAT的平均測定間變異系數分別為5.32%、6.83%、3.52%和4.94%。