研究簡介:Methanococcus maripaludis是一種嗜溫產甲烷菌，能夠利用氫氣（H?）或甲酸鹽（formate）將二氧化碳（CO?）還原為甲烷（CH?）以獲取能量。這種菌在鹽沼沉積物中很常見，具有多種氫化酶，這些酶在氫氣代謝中起重要作用。由于氫氣是一種清潔且高效的能源，研究人員希望探索這種產甲烷菌利用甲酸鹽產生氫氣的潛力，以期為生物制氫提供新的思路。以甲酸鹽或H2生長的靜息細胞的比活性為0.4至1.4 U·mg-1(干重)。甲酸鹽生長的細胞中H2生產遵循米氏動力學，甲酸鹽的半最大活性濃度(Kf)為3.6 mM。相比之下，H2生長的細胞中此過程遵循S型動力學，Kf為9 mM。甲酸鹽依賴的H2生產的關鍵酶是甲酸脫氫酶Fdh。在缺失編碼Fdh1同工酶的基因的突變體中，H2生產和生長嚴重減少，表明Fdh1是主要的甲酸脫氫酶。相反缺失編碼Fdh2同工酶的基因的突變體具有接近野生型的活性，表明該同工酶不起主要作用。缺失輔酶F420還原氫化酶Fru的突變體的H2生產也嚴重減少，表明主要的H2生產途徑由Fdh1和Fru組成。由于Δfru-Δfrc突變體保留了10%的野生型活性，因此還存在另一條途徑。缺失編碼F420依賴的亞甲基-H4 MTP脫氫酶(Mtd)或H2形成的亞甲基-H4 MTP脫氫酶(Hmd)的突變體活性也降低，表明第二條途徑由Fdh1-Mtd-Hmd組成。與H2生產不同，這些突變體中甲烷生成的細胞速率未受影響，表明觀察到的H2生產并非甲烷生成的直接中間產物。甲酸鹽依賴的高速率H2生產展示了M.maripaludis從甲酸鹽微生物生產H2的潛力。

Unisense氫氣微電極系統的應用

Unisense微電極被用于精確測量Methanococcus maripaludis在厭氧條件下從甲酸鹽產生氫氣（H?）的濃度和速率。將細胞懸浮液加入到含有Unisense微電極的反應比色皿中，通過改良的安培式氧氣克拉克型電極連接到Unisense picoammeter PA2000，實時監測溶解氫氣的濃度。通過對Unisense微電極測量數據分析發現，M.maripaludis在最初的1分鐘內從甲酸鹽產生氫氣的速率呈線性增長，隨后速率下降直至達到平衡。氫氣產生的最大濃度在0.4到0.8 mM之間，接近理論平衡濃度3 mM。

實驗結論

M.maripaludis能夠高效地從甲酸鹽產生氫氣，其產氫速率在不同生長條件下表現出顯著差異。在最佳條件下，產氫速率可達1.4 U/mg（干重），這在已知的微生物中屬于較高水平。氫氣產生的速率和動力學特性受到生長條件的顯著影響，尤其是氫氣的可用性。在氫氣限制條件下生長的細胞表現出更高的產氫活性。通過基因敲除實驗，研究發現Fdh1是甲酸鹽依賴性氫氣產生的主要酶，而Fdh2的作用較小。Fdh1缺失的突變株在甲酸鹽利用和氫氣產生方面表現出嚴重缺陷，而Fdh2缺失的突變株則接近野生型水平。甲酸鹽依賴的氫氣產生遵循米氏動力學（Michaelis-Menten kinetics），其半飽和常數（Kf）為3.6 mM，表明Fdh1對甲酸鹽的親和力較高。氫氣產生的速率與甲烷生成的速率相當，但實驗結果表明，氫氣并非甲烷生成過程中的必需中間體。在某些突變株中，氫氣產生顯著減少，但甲烷生成并未受到顯著影響。這表明M.maripaludis在甲酸鹽代謝中可能存在其他電子傳遞途徑，氫氣的產生可能是代謝過程中的副產物。

圖1、氫營養型產甲烷菌中H2合成的潛在途徑。第一條途徑包含Fdh和Fru。在該途徑中，Fdh還原F420。在含硒培養的細胞中，F420H2被[Ni-Fe]氫化酶Fru氧化。第二條途徑中，F420H2被Mtd氧化，將亞甲基-H4MPT還原為亞甲基-H4MPT，隨后被不含鎳的氫化酶Hmd重新氧化產生H2。

圖2、M.maripaludis靜息細胞從甲酸鹽產生H2的初始速率(實線)。細胞以甲酸鹽培養，經緩沖液洗滌后重懸于反應比色皿中。通過添加20 mM甲酸鈉(箭頭)啟動反應。虛線顯示未添加甲酸鹽的細胞懸浮液孵育結果。

圖3、H2限制條件下生長的靜息細胞甲酸鹽依賴H2生產的變化。野生型S2在1升Wheaton瓶中用100 ml肉湯培養，分別使用基本培養基McNA(○)和豐富培養基McCV(●)。實驗開始時，瓶子用138 kPa H2-CO2(80:20[體積比])加壓。在不同吸光度時采集細胞樣品(20 ml)，如插圖中生長曲線上的點所示。每次取樣后，瓶子用N2-CO2(80:20[體積比])重新加壓。這導致H2限制但維持CO2濃度。

圖4、野生型和fdh突變株在H2或甲酸鹽條件下的生長情況。實心符號表示H2(276 kPa；H2-CO2 80:20[體積比])條件下的生長；空心符號表示甲酸鹽(100 mM)條件下的生長。圓形代表S2；倒三角形代表ΔfdhA1；方形代表ΔfdhA2；菱形代表ΔfdhA1-ΔfdhA2。每個數據點代表兩次重復實驗的平均值。

圖5、野生型菌株S2靜息細胞的甲酸鹽依賴性H2生產動力學，該菌株先前分別在H2(A)或甲酸鹽(B)條件下培養。ΔfdhA2突變體的動力學如插圖所示。S2和ΔfdhA2突變株分別培養至吸光度約0.8和0.6。

結論與展望

本論文研究了嗜溫產甲烷菌Methanococcus maripaludis利用甲酸鹽（formate）產生氫氣（H?）的特性及其潛在應用。M.maripaludis是一種能夠利用氫氣或甲酸鹽將二氧化碳還原為甲烷的產甲烷菌，其在鹽沼沉積物中廣泛存在，并且具有多種氫化酶，這些酶在氫氣代謝中起重要作用。本研究旨在探索這種菌利用甲酸鹽產生氫氣的能力，為生物制氫提供新的思路。研究人員使用了M.maripaludis的野生型菌株S2及其突變株。菌株在含有甲酸鹽或氫氣的培養基中生長，實驗中還使用了不同的培養基成分和氣體壓力條件。通過定制的厭氧水浴比色皿和改良的安培式氧氣克拉克電極（unisense）測量溶解氫氣的濃度，同時通過氣相色譜法檢測甲烷的產生。此外研究還制備了細胞提取物，并通過光譜法測定甲酸脫氫酶（Fdh）和F420還原氫化酶的活性。Unisense微電極在本研究中被用于精確測量Methanococcus maripaludis在厭氧條件下從甲酸鹽產生氫氣（H?）的濃度和速率。通過分析unisense精確測量氫氣的產生速率和濃度，為研究M.maripaludis的氫氣代謝機制提供了關鍵數據,。本論文深入探討了M.maripaludis在生物制氫方面的潛力，還揭示了其氫氣產生機制，為未來開發高效的生物制氫系統提供了重要的理論基礎和實驗數據。